汇报人：LuYinLab研究生三年级成鹏
研究背景
非酒精性脂肪肝疾病（NAFLD）是代谢综合征的肝脏表现，其由肥胖，糖尿病，胰岛素抵抗和血脂异常的共同特征所定义。在西方国家和亚洲，NAFLD现在被认为是慢性肝病的最常见原因。据估计，NAFLD在美国成年人口中占30-40％。
非酒精性脂肪肝疾病的特征是单纯脂肪变性，没有肝炎症状，而其有可能进一步转换为NASH。非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的特征还在于脂肪变性和肝脏的炎性特点，并伴有气球样变性。可以看到许多气球状肝细胞。在与NASH相关的肝纤维化/肝硬化中，再生结节周围有桥接的纤维间隔（天狼星红染色）。
实际上，近年来，人们提出将NASH作为HCC的重要病因。并且，随着肥胖，糖尿病和代谢综合征的患病率在全世界的稳定增加，这部分人群患有NASH的概率将会增大，进而面临着发展成为肝癌的风险，因此探究NASH发病的相关机制，开发特异性药物十分重要。
而与代谢综合症，糖尿病及胰岛素抵抗等密切相关的呢，首要就是肠道微生物，正常情况下肠道内菌群间大部分维持着共生或拮抗的关系。人体肠道内有多种微生物群落，它们与宿主的共生关系促进了新陈代谢和消化。干扰其稳态可能导致疾病。年胃肠杂志已经报道破坏肠道动态平衡并导致非酒精性脂肪肝，脂肪性肝炎，酒精性肝病和肝硬化等疾病。
而本文的由来，则是基于年，该实验室所发表的一篇名为：肠血管屏障调控细菌的全身性扩散而来。该篇文章发表于science上，文中提出的肠血管屏障控制菌群的扩散观点十分新颖，因此本文基于肠血管屏障观点，探讨其在非酒精脂肪肝炎中扮演的角色。而肠道微生物在NASH发生发展中扮演什么样的角色呢，因此本文也基于肠血管屏障，探讨肠道微生物与NASH的相关性。
本文“Microbiota-drivengutvascularbarrierdisruptionisaprerequisitefornon-alcoholicsteatohepatitisdevelopment”于19年12月发表于《JournalofHepatology》，影响因子：20.58
研究内容
R1：Intestinalepithelialandvascularbarrierdisruptionareearlyeventsinhigh-fatdietaryregimen
为了了解在高脂饮食条件下，小鼠的肠上皮屏障（IEB）及血管屏障GVB）会发生怎么样的变化，作者采用饱和脂肪含量45%的饲料诱导小鼠代谢紊乱。饲养48h后与等量热量的淀粉饮食进行比较发现，以细胞上皮损伤的代表性紧密连接蛋白ZO-1（如图AB上所示）进行观察，发现高脂饮食组细胞上皮ZO-1表达明显减少，。由Ctrl及HFD喂养的小鼠的回肠及盲肠中细菌CFU培养发现，菌群CUF明显上升，说明菌群向回肠及盲肠固有层的迁移（图C）。考查了上皮层的损伤，作者继续考察血管屏障的损伤，以浆膜囊泡相关蛋白1（PV-1）展开，其在微血管通透性中发挥重要作用。然而48h中在对照组与高脂饮食组并没有发现PV-1的表达有显著性改变（第三行图片的荧光强度）。因此作者将高脂饮食饲养时间延长为一周，发现在回肠及盲肠上皮及内皮细胞中都发现了ZO-1的表达下调及PV的表达增加（如图D所示），与流式结果呈现一致性。
除开ZO-1，作者同时也考察了Occludin,Claudin-3andClaudin-5等三种紧密连接蛋白，发现并没被高脂饮食所调节。与此同时，高脂饮食诱导的PV-1表达上升现象在空肠及结肠中也得到论证，流式结果呈现一致性(如F-G图所示）
这些结果展示了高脂饮食中肠道一系列动态变化，由肠道上皮屏障损伤促进菌群及其代谢产物从肠腔移位并损伤血管屏障。为了验证这一结果，研究人员向小鼠灌胃LPS模拟急性病原体分子入侵。以观察回肠中的变化。24h时，小鼠出现ZO-1表达的减少；48h时，LPS促进了PV-1在内皮细胞中的表达，并都呈现剂量依赖性，流式结果呈现一致性。
那么血管屏障的损伤会促进肝脏发生炎症反应吗？作者将高脂饮食饲料中脂肪含量由45%提升至60%(60%的高脂饮食会造成肝脏中炎症水平），饲养小鼠24周，由PV-1的表达发现，在回肠及结肠中血管屏障是遭到破坏的，流式中PV-1荧光强度的检测呈现一致的结果（如图AB所示）。同时对血清中的LPS水平进行检测，发现LPS血清浓度的上升（图C）。高脂饮食长期喂养对于肝脏的影响，作者也进行了检验，由肝脏的油红O染色，天狼星红染色及肝损标志性ALT（氨基转酶移）水平检测发现，高脂饮食诱导了肝脏的脂质堆积和纤维化，促进了肝脏ALT水平的升高，而这些都印证了非酒精性脂肪性肝炎的产生。相关指标同时检测了小鼠葡萄糖耐受及胰岛素耐受水平发现，高脂饮食诱导小鼠两者耐受增加。而炎症水平则检测了肝脏中的促炎因子水平，包括IFN-γ,IL33和CCL2，免疫细胞包括CD45、CD4+、CD8+、单核细胞及巨噬细胞的水平。均发现不同程度的上升，直接说明了肝脏中炎症水平的增加。
以上的结果说明，高脂饮食饲养的早期，肠道上皮屏障的损伤会造成细菌及其代谢产物的的移位，随着时间增加，会造成血管屏障的损伤，并且血管屏障损伤贯穿高脂饮食所诱导的相关疾病，如非酒精性脂肪性肝炎。
R2：Increasedvascularpermeabilityallowsbacterialtranslocationtotheliver
那么血管屏障的持续损伤状态，会不会促使细菌向肝脏中的转移呢？之前讲过，作者已经发现了菌群向肠道固有层的移位，而由血管屏障的持续性及损伤程度的增加，作者猜想肝脏中是否能检测到细菌呢？
因此作者对高脂饮食饲养一周的小鼠肝脏组织进行细菌荧光原位杂交实验。作者将绿色细菌探针标记细菌，白色CD45标记免疫细胞，以观察细菌移位情况。发现在对照组小鼠肝脏中几乎没有细菌，偶尔出现的细菌也全被免疫细胞所包裹，而高脂饮食组小鼠肝脏中细菌，出现在了肝脏实质部分，而非被免疫细胞所包裹，表明它们可以自由迁移至肝脏，如图AB所示（作者在这里表示，这些细菌是否是常驻肝脏菌群还是从其他地方移位过来，关于这部分移位机制不明），并且高脂饮食组LPS水平显著高于对照组（图C所示）。
那么GVB损伤到什么程度可以发生上述菌群移位呢？作者在此就对血管屏障的功能性进行评价，通过内窥镜对内皮渗漏情况进行分析。高脂饮食饲养一周的小鼠用大分子量葡聚糖通过尾静脉注射，葡聚糖用FITC进行标记，分子量为kDa，模拟细菌的大小。0-30min采用荧光活体内窥镜检测，评估葡聚糖渗漏至回肠肠腔的情况。只有在血管屏障损伤的情况下，葡聚糖才能从血管中渗漏至肠腔固有层，从图D-F中能看到，高脂饮食组血管腔中染料强度逐渐减弱，也就说明回肠端血管存在渗漏情况。
虽然肠道上皮屏障及血管屏障发生损伤，并且小鼠体重及脂肪组织有所增加，但是通过油红O染色及HE染色并没有发现脂肪细胞增大及胰腺损伤的情况，说明肠上皮及血管屏障损伤先于肝脏脂肪变性及胰腺损伤。
相同结果都在6周高脂饮食雌性小鼠中存在（雌性小鼠对于代谢紊乱等有着比雄鼠更好的耐受水平），在发现IEB及GVB损伤，体重及脂肪组织增加同时，并没有发现肝脏出现脂肪变性及胰岛素抗性等，同时肠道血管内皮细胞上PV-1及ZO-1表达减少。
综上所述，由内皮通透性的增加及菌群移位至肝脏表明GVB的损伤是非酒精性脂肪性肝炎的早期现象，先于脂肪肝发生。
R3：AdysbioticmicrobiotacanaffectGVBintegrity
上文中，曾提到回肠和盲肠的菌群移位是高脂饮食的早期特征，那么菌群在GVB的损伤中究竟扮演什么样的角色呢？
作者的观察表明，与SPF小鼠相比，成年无菌小鼠的PV1表达增加，表明微生物群可能参与了控制GVB的活动（数据并未呈现），但是成年无菌小鼠的菌群重建并不会导致PV-1表达正常化，说明GVB损伤至少不能在成年小鼠中由菌群重建所纠正，并且无菌小鼠并不会被高脂饮食诱导产生非酒精性脂肪性肝炎，侧面上面也证实了菌群参与到NASH发生发展过程（这部分数据，作者并没有呈现）。
基于上述原因，作者从粪菌移植实验入手，将饲养一周高脂饮食的C57小鼠肠道内容物喂养给对照组小鼠观察脂肪组织重量及PV-1在回肠中表达情况，发现移植过粪便的小鼠，脂肪组织及PV-1的表达均有所上升，也就说明HFD所诱导的菌群紊乱，在损伤GVB及影响血管通透性中，确实发挥重要作用
以上的实验已经明确了HFD诱导的NASH中GVB损伤的现象，且GVB的损伤由菌群所驱动，但是GVB在NASH中扮演何种角色并没有明确。作者15发表的文章对于GVB损伤的机制曾进行初步探究，即沙门氏菌所采用的诱导GVB破坏的机制是对内皮细胞中WNT/β-catenin信号通路干扰。因此作者继续
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