汇报人：LuYinLab研究生一年级刘欢
本篇文章IL-20antagonistsuppressesPD-L1expressionandprolongssurvivalinpancreaticcancermodels于年发表在NatureCommunications，影响因子为12.。文章通讯作者为台湾国立成功大学医学院基础医学研究所、国立成功大学医学院生物化学与分子生物学系教授Ming-ShiChan。
文章背景
胰腺导管腺癌（PDAC）可较早诊断，然而其预后依然较差，其中原癌基因KRAS和肿瘤抑制基因TP53的突变是重要原因。据报道，PDAC微环境中肿瘤细胞和浸润性免疫细胞分泌的促炎细胞因子（如IL-1b、IL-6、TNF-a）可调节PDAC的进程和免疫逃避。
巨噬细胞可分化为M1表型抑制肿瘤或分化为M2表型促进肿瘤发生和免疫抑制。与肿瘤相关的巨噬细胞（TAM）伴随肿瘤微环境进行功能性转化，其为M2表型。在PDAC微环境中，PD-L1在癌细胞中高表达，促进免疫逃逸和癌症进展。研究表明，针对PD-L1进行PDAC单一治疗并不成功，除了免疫抑制，PDAC还伴有组织纤维化，胰腺肿瘤激活成纤维细胞，导致胰腺组织纤维化增强，进一步促进肿瘤发生发展。故靶向组织纤维化并抑制肿瘤免疫的联合疗法是治疗PDAC的潜在途径。
PDAC晚期患者经常出现恶病质（CAC），加速缩短患者生存时间。据报道，促炎细胞因子（如IL-1b，IL-6，TNF-a和IFN-g）是CAC的关键介质，故靶向这些细胞因子已被建议作为干预恶病质的潜在措施。而PDAC进展和CAC发展过程中癌细胞与肿瘤相关免疫细胞之间相互作用的潜在机制仍不清楚。
促炎细胞因子IL-20是IL-10家族的成员。据报道，IL-20通过激活IL-20R1/IL-20R2或IL-22R1/IL-20R2异二聚体受体复合物来影响多种细胞类型。在免疫调节中，IL-20诱导单核细胞产生趋化因子配体2并调节免疫防御机制。在多种炎症性疾病中，IL-20表达显著上调，在癌症中亦是。
此团队之前有过报道，IL-20可促进肿瘤生长并增加肝细胞癌、乳腺癌、前列腺癌和口腔癌的转移，他们开发了抗IL-20单克隆抗体7E，可抑制人和小鼠IL-20体内、外活性，也可有效缓解炎症并抑制肿瘤的生长。但IL-20与PDAC进展的相关性以及靶向IL-20是否可以作为PDAC的有效疗法，均尚不明确。
结果分析
01
IL-20与患者PD-L1水平及存活率相关
通过IHC分析了72例PDAC患者肿瘤组织样品中IL-20的表达，发现其在肿瘤细胞和肿瘤性导管上皮细胞中强烈表达，而在胰腺非肿瘤组织中仅显示导管上皮细胞低表达（图1a）。IL-20表达相对较高时，患者总生存率较差（图1b）。团队还发现PD-L1在PDAC患者中高表达（图1c），且IL-20与PD-L1的表达显著相关（图1d）。
团队通过KPC小鼠模拟人类PDAC进程。IHC显示KPC型小鼠胰腺肿瘤组织中IL-20表达显著高于野生型（WT）小鼠（图1e）。与PBS或小鼠免疫球蛋白（mIgG）相比，用7E处理后，可显著延长KPC小鼠的生存期（图1f），且有效减少了Ki-67+增殖细胞的数量（图1g）。且7E可显著抑制PD-L1表达，小鼠生存期更长（图1h）。
胰腺纤维化对PDAC进展有着重要作用，此团队曾报道过IL-20促进肝纤维化。他们通过IHC评估了纤维化标志a-平滑肌肌动蛋白（a-SMA）的分布，相比在PBS和mIgG条件下，KPC小鼠a-SMA在7E条件下则显著降低（图1i）。
图1
02
阻滞IL-20可抑制原位胰腺肿瘤的生长
7E阻滞IL-20后，团队询问其是否可以抑制原位胰腺肿瘤的生长。用萤光素酶报道基因（KPC/Luc细胞）转染KPC鼠分离出的胰腺肿瘤细胞，发现7E可显著抑制体内肿瘤的生长（图2a）。7E组肿瘤体积和重量显著小于mIgG、PBS组（图2a、b）。与PBS、mIgG组相比，7E组小鼠生存期延长且a-SMA表达降低（图2c、d）。亦显示7E可抑制与纤维生成相关的标志物的表达，如a-SMA、胶原蛋白、转化生长因子等（图2e）。通过ELISA分析，发现KPC小鼠血清中IL-20水平显著高于正常小鼠，原位PDAC小鼠有相似的结果。经7E治疗，两种模型小鼠血清中IL-20水平均降低（图S1a、b）。上述实验结果表明，IL-20不仅在肿瘤组织中高表达，且在全身也有表达。
图2
图S1
03
抑制IL-20可减弱癌细胞的增殖
IHC染色显示，非肿瘤胰腺组织中只有在肿瘤细胞上观察到IL-20受体的阳性染色，未在基质细胞上观察到（图S2a）。免疫染色显示人和鼠胰腺癌细胞系均表达IL-20及其受体（图S2b）。MTT分析表明7E可抑制胰腺癌细胞系中IL-20介导的细胞增殖（图S2c-e）。故IL-20对胰腺癌细胞的增殖至关重要。
图S2
04
敲低KPC细胞IL-20R1可抑制肿瘤生长
7E对IL-20的抑制作用会减缓体内肿瘤的生长（图1、2），团队猜测这可能归因于肿瘤微环境中IL-20自身分泌的减少。为此，团队生成了IL-20R1敲低的KPC细胞（图S3），并原位注射到小鼠的胰腺中。与亲本KPC肿瘤组相比，IL-20R1KD组的肿瘤体积和重量显著降低（图2f、g），表明IL-20R1有助于KPC细胞的致癌活性。
图S3
05
阻断IL-20可抑制体内、外M2型巨噬细胞
团队将肿瘤组织样本中巨噬细胞标记物（F4/80）和M2型巨噬细胞标记物（CD）进行染色。7E组F4/80+巨噬细胞和CD+巨噬细胞减少（图3a），表明抑制IL-20可能会减少原位模型胰腺肿瘤中M2型巨噬细胞的数量。骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMs）与IL-20孵育48h，并对巨噬细胞分化进行分析（图3b），显示IL-20可上调CD+巨噬细胞数量，而7E可抑制IL-20诱导的CD+巨噬细胞分化（图3c；图S4）。相反，IL-20的阻断会增加CD86+（M1型巨噬细胞标志物）巨噬细胞的分化（图3c）。
图3
图S4
06
IL-20上调原位模型肿瘤PD-L1水平
免疫荧光染色显示IL-20和PD-L1在小鼠胰腺肿瘤中共定位，这表明IL-20可能参与对PD-L1的调控（图4a）。RT-PCR显示，经IL-20处理的KPC细胞，其PD-L1表达上调，而7E则阻断了IL-20的活性（图4b）。团队根据最新的研究，即IFN-a与PD-L1的诱导相关，询问IL-20是否通过激活IFN-a来上调PD-L1。通过RT-qPCR，发现IL-20可上调IFN-a表达，而7E抑制了此作用（图4c、d）。抗IFN-a抗体通过抑制IFN-a活性，进而完全抑制了IL-20对PD-L1表达的作用，表明IL-20通过IFN-a促进PD-L1的表达（图4e）。通过体外实验，团队推测阻断IL-20会抑制体内PD-L1表达，7E组PD-L1表达明显低于PBS、mIgG组（图4f）。上述实验证明7E在体内和体外均可降低PD-L1表达。
07
阻断IL-20可促进CD8+T细胞的浸润
有报道表明，PDAC中激活的T细胞其表面PD-1表达升高。团队猜测7E是否通过T细胞杀伤肿瘤细胞，他们对原位PDAC模型和KPC小鼠的肿瘤组织样品进行抗CD8抗体IHC染色。在这两种模型中，7E组小鼠CD8和PD-1的表达增加，而在PBS、mIgG组中未观察到，这表明7E可促进CD8+T细胞向肿瘤组织浸润（图4g、h）。团队生成了ASID小鼠的PDAC原位模型，发现7E组小鼠的肿瘤体积和重量仍然小于PBS、mIgG组（图4i–k），表明IL-20阻断剂可直接抑制肿瘤生长。
08
7E联合抗PD-1抗体显示出更好的疗效
通过上述实验，团队推测7E与免疫检查点抑制联合使用可增强CD8+T细胞活性，在胰腺癌治疗中可能产生协同效应。这在原位PDAC模型中得到了实验验证，与单独使用7E或抗PD-1抗体相比，联合使用对肿瘤的杀伤性更强（图4l–n）。
图4
09
阻断IL-20可改善KPC肿瘤模型中的恶病质
上述实验使得团队推测阻断IL-20可改善CAC。与健康小鼠相比，荷瘤小鼠食欲不振、体重下降，而当7E治疗后，此现象慢慢消失（图5a、b）。还显示7E可预防癌症引起的脂肪丢失（图5c）、减少巨噬细胞向脂肪组织的浸润（图5d）以及保留脂肪组织的完整（图5e、f）。
大多数癌症恶病质伴有肌肉消瘦，其中肌肉消瘦标志物DAG-1的表达在肌肉组织中增强。在小鼠原位模型PBS、mIgG组中，DAG-1在比目鱼肌中明显表达（图5g）。当7E处理后，DAG-1表达无降低，表明IL-20可能不参与癌症引起的肌肉消瘦。
图5
10
7E在路易斯肺癌（LLC）模型中的抗恶病质作用
与PBS、mIgG组相比，小鼠接种LLC肿瘤细胞后，其体重明显下降，而7E可防止癌症引起的体重减轻（图6a），且食欲没有减退（图6b）。但在该模型中，未发现7E治疗可减少LLC肿瘤块（图6c）或癌症引起的肌肉消瘦（图6d、e）。与原位KPC肿瘤模型一致，7E组小鼠的脂肪未被明显分解（图6f），但在PBS、mIgG组中脂肪分解明显（图6g、h）。
图6
11
7E可防止脂肪流失并降低血清甘油三酸酯（TAG）含量
白色脂肪组织（WAT）的褐变、脂肪分解的增加是CAC诱导脂肪流失的两个主要原因。与褐变相关的基因Ucp1、Pgc1、Dio2和Prdm16在7E和mIgG治疗组中未显示表达差异（图S5a–d）。故团队探讨7E是否通过抑制脂解作用来减少LLC诱导的CAC模型中的脂肪损失。脂肪分解的增加与脂肪分解酶HSL和ATGL的活化有关，7E治疗后显着降低HSL和ATGL基因表达（图7a，b）。这一点在IHC染色中得到了证实（图7c）。CAC鼠模型显示血清中脂肪酸和甘油的含量增加，表明TAG分解代谢增加和脂肪储量下降，在LLC小鼠中，PBS、mIgG组TAG水平显著升高，但7E组TAG水平降低（图7d）。上述实验结果表明，IL-20参与CAC异常脂质代谢，但可以被7E拮抗。
图S5
12
7E减少F4/80+巨噬细胞向脂肪组织的浸润
巨噬细胞对CAC发病机制起重要作用，故团队开始探讨IL-20是否参与巨噬细胞向脂肪组织的浸润。免疫荧光染色显示，IL-20与F4/80+巨噬细胞在脂肪组织中共定位，7E可显著降低两者数量（图7e）。团队分离出鼠脂肪细胞，并与IL-20共培养，发现IL-20不影响脂解基因ATGL和HSL的表达（图7f、g），这表明IL-20可能通过诱导肿瘤衍生的脂解因子而间接促进脂解，如TNF-a。为了验证这一假设，团队用含mIL-20的培养基培养LLC细胞24h，然后在没有IL-20的新鲜培养基中再培养24小时，再将原始脂肪细胞与7E或抗TNF-a抗体分别孵育24小时。发现经IL-20后，带有LLC细胞的培养基可增加脂肪细胞中ATGL和HSL的表达，且7E对抑制IL-20驱动脂解的旁分泌作用比抗TNF-a抗体更有效（图7h、i）。实验结果表明，IL-20可能通过诱导TNF-a参与脂质分解。
13
抑制IL-20R1可预防LLC诱导的CAC
接着团队研究了在LLC模型中抑制IL-20R1是否可预防CAC症状。他们将LLC细胞接种到IL-20R1-/-和WT小鼠体内，IL-20R1-/-小鼠体重减轻的程度小于WT小鼠（图7j），但两组的肿瘤重量无明显差异（图7k）。与WT小鼠相比，IL-20R1-/-小鼠的脂肪量更大，甘油三酯水平更低（图7l、m），还观察到IL-20R1-/-小鼠脂肪未萎缩以及免疫细胞未浸润到脂肪中（图7n）。
这些结果进一步证实了阻断IL-20信号传导对CAC具有潜在治疗作用。
图7
总结与讨论
这篇文章首先探索了IL-20对促进PDAC发生发展的作用，通过实验表明7E在原位肿瘤模型和KPC小鼠模型中对IL-20具有阻断作用，且7E阻断IL-20后可以延长小鼠生存期并减轻胰腺纤维化、降低肿瘤细胞PD-L1的表达，抑制肿瘤的生长，并减轻TAM的浸润。此外，7E治疗可减轻CAC症状，如减少与肿瘤相关的体重减轻、维持食物摄入以及减少脂肪组织中的脂肪分解。
这篇文章认为，以7E为代表的靶向IL-20治疗策略，可能对治疗PDAC和CAC提供了新思路、新策略，扩展了免疫治疗思维，及免疫疗法可与传统的信号通路疗法联合作用，这对肿瘤的杀伤可能有着较好作用。
导师：陆茵
稿件编辑：刘欢
稿件审阅：陆茵
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇转载请注明：http://www.twwak.com/jbby/11207.html
