正文结果
1.发现患病肝组织中广泛的体细胞突变
为了不偏不倚地调查肝脏疾病的突变，本文分析了总共82例患者组织样本（53例早期肝癌患者的非肝癌组织，22例TCGA数据库肝癌病人的非肝癌组织，6例肝硬化肝移植病肝样本，1例正常肝）以及配对血液，首先做了全外显子测序。每个组织样本的重量在4到28毫克之间（平均=16.5毫克），每个维度约为2.5毫米，总共鉴定出个体细胞突变，每个样品的平均突变为4.74，错义突变是最常见的突变，其次是同义，无意义，剪接位点和移码突变。同时肝组织中每个样品的绝对突变计数与胃癌和肝母细胞瘤队列相似，但低于尤因氏肉瘤，横纹肌肉瘤，肾透明细胞癌，HCC和肺腺癌队列。当使用VAF计算每个碱基对的基因组DNA突变率时，肝脏的突变率低于所有分析的癌症。尽管HCC的突变计数更高，但单核苷酸变异（SNV）模式相似，这支持诱变的平行机制（图D）。随后本文分析了突变的临床相关性，发现纤维化程度和突变数成正相关，突变数和ALT、AST水平也成正相关。
2.超深度靶向测序可识别复发性体细胞突变
由于整个外显子组数据主要产生5-15％的VAF突变，很可能未检测到很大一部分VAF5％的体细胞突变。因此，本文对个基因（在HCC中经常突变的29个基因和在患病的肝脏外显子组中突变的个基因）进行了超深度靶向重测序。发现了在肝癌中未观察到过的许多突变基因（PKD1，PPARGC1B，KMT2D，ALMS1，PKHD1）。同时在两名以上的患者中，仅检测到HCC中29个最突变的基因中的5个，并且不包括CTNNB1，RB1，AXIN1和KEAP1（这是一些最成熟的HCC驱动基因）。这表明突变在HCC和慢性病肝之间存在明显的选择压力。
3.结节内的突变是克隆扩增的
肝脏的基本组织学是小叶，在再生过程中，小叶扩张并发展为结节，但肝细胞不太可能移出结节边界。由于这种限制性结构，研究者不希望VAF高于25％发生突变，尤其是对包含多个结节的样品进行批量测序时，故本文对单个独立的再生结节进行了超深度测序。结果发现突变克隆的体积和结节的体积相似，这支持了克隆大小不能扩展到结节大小以外并且存在对克隆大小的空间限制的想法。并且发现随着时间的推移，突变克隆的数量和体积都随着肝纤维化和损伤的增加而增加。
为了检验结节结构可以物理抑制克隆增长的想法，我们分析了11位患者来自同一肝脏的4–7个组织碎片上进行的多位点超深度测序。在这些患者中发现的总共个突变中，只有7对被共享。少数重叠突变支持结节结构抑制广泛的克隆生长的概念，因此结节内的大多数突变都是私有的。
11个肝硬化病人样本，每个样本取4-7个结节做超深度测序。
4.体内CRISPR筛选鉴定出了介导克隆性肝扩张的基因
为了鉴定在慢性肝病背景下调节肝再生的基因，本文在FahKO小鼠（该小鼠模拟了一种称为遗传性酪氨酸血症的单基因退行性肝病，如果不加以治疗，最终会导致肝硬化）中设计了一个CRISPR/Cas9筛选。为了广泛评估与肝脏测序有关的基因，研究者生成了一个sgRNA文库，其中包含个指南，这些指南针对测序研究中鉴定的个突变基因。接着他们将编码sgRNA和FAH的转座子质粒库以尾静脉高压注射的方式递送到FahKO小鼠中，这样每只小鼠都接收了整个文库，许多携带不同sgRNA的转染和FAH拯救的肝细胞克隆会在肝脏再生过程中相互竞争，并且在再生肝细胞克隆中具有选择性优势的sgRNA相对于其他克隆而言将被过度表达。一个月后，通过深度测序对重新组装的sgRNA进行了定量发现针对Arid1a，Pten，Pkd1和Kmt2d的不同sgRNA始终在接受筛选的单个小鼠中富集。
5.基因靶向小鼠证实调节肝脏再生的基因
Pten和Arid1a编码特征明确的肿瘤抑制因子，已知可抑制肝脏生长。该团队之前曾证明缺乏Arid1a的肝细胞在肝脏中具有增强的再生能力。为了更严格地评估新的肝脏再生调节基因的功能，本文有条件地从小鼠肝细胞中删除了Arid1a，Kmt2d或Pkd1。与CRISPR筛选的结果一致，Arid1a，Kmt2d或Pkd1的部分功能丧失，对肝细胞的肝损伤反应也具有选择性优势，它们的缺失可以减轻肝脏的损伤保护肝脏。
总结
本文的角度十分新颖，聚焦于慢性肝脏疾病的（主要是肝硬化）突变。往往我们认为肝癌的发生源于慢性的肝脏病变，那么突变应该也是从慢性肝脏病变继承过来的。但是，ZhuHao团队通过超深度测序发现事实并非如此，慢性肝脏损伤造成的突变可以促进再生，且不同于肝癌的突变，可能独立于癌变。这一发现打破原本慢性肝损伤到肝硬化最终到肝癌的发展定式，同时还肝硬化可能是保护肝脏免于肝癌的一种发展过程。同时有意思的是，由于肝小叶这一结构每个再生结节的突变基本是独立的，这也足够推测肝癌的异质性极大可能是由于肝小叶这一结构因素造成的。最后的体内实验证明在年看来并无太大的亮点，因为高压注射模型已经运用的很成熟了，不过这部分实验保证了文章的完整性，也是不可或缺的。
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