今天和大家分享一篇发表于Biomaterials杂志上题为“Clodronate-loadedliposomalandfibroblast-derivedexosomalhybridsystemforenhanceddrugdeliverytopulmonaryfibrosis”的研究性论文，该文介绍了一种氯膦酸钠(CLD)脂质体和成纤维细胞来源的外泌体杂化(EL-CLD)给药系统，成功应用于肺纤维化的治疗。
研究背景
肺纤维化是一种进展迅速、致命性强的纤维性肺部疾病，具有较高的死亡率和发病率。然而，抗肺纤维化药物选择性差、给药效率低，难以阻止纤维化的恶化。因此，开发有效的纳米给药系统来改善药物在肺纤维化组织中的蓄积和归巢是非常有必要的。但肺纤维化治疗的纳米颗粒受到严重限制药物输送的生物障碍（细胞外基质和过多的纤维化胶原沉积）。为此，作者设计了一种非特异性吞噬抑制和成纤维细胞归巢特性的氯膦酸钠(CLD)脂质体和成纤维细胞来源的外泌体杂化(EL-CLD)给药系统，将尼达尼布（NIN）载入EL-CLD，以验证潜在增强的抗纤维化效果，并阐明了NIN-EL-CLD给药系统提高抗纤维化效果的机制。
研究内容
1.EL-CLD的制备与表征
首先，作者采用超速离心法和过滤法从L-细胞条件培养液中提取外泌体，并用TEM和DLS对分离的外泌体进行了表征(Fig.1A和1B)。为确认外泌体的特性，以Westernblotting分析L-细胞分泌外泌体中的蛋白质，表明外泌体标记蛋白的存在，如CD9和HSP70(Fig.1C)。之后，采用反向蒸发法制备CLD脂质体(L-CLD)，并将脂质体与外泌体以5:1比例制成外泌体杂化脂质体(EL-CLD)，EL-CLD呈球形结构，颗粒均匀，双层膜明显，平均粒径为~nm(Fig.1D,1E和1F)。此外，FRET（荧光共振能量转移）实验（膜融合技术）研究了外切体和脂质体的杂交效率，以荧光供体(PE-NBD)和荧光受体(PE-RhB)为制备FRET脂质体，当供体和受体非常接近时，能量从供体转移到受体而使供体能量最小化，由于外泌体插入FRET脂质体使FRET活性显著降低，即表明外泌体已插入脂质体的脂质双层(Fig.1G和1H)。
2.EL-CLD在体外巨噬细胞和成纤维细胞中的双重性质
由于L-CLD被巨噬细胞识别并吞噬，从而抑制巨噬细胞的存活。因此，作者进行了细胞摄取、毒性和核荧光形态学研究，以评估EL-CLD对RAW.7巨噬细胞的消耗。细胞摄取实验发现4h时空白脂质体中C6的绿色荧光强于负载CLD的脂质体，这可能与脂质体中CLD的消耗作用有关(Fig.2A和2B)。EL-CLD和L-CLD也表现出与游离CLD相似的细胞毒性(Fig.2C)。核染色检测CLD脂质体诱导RAW.7细胞凋亡的能力(Fig.2D)，发现未经处理的RAW.7细胞的核荧光均匀，没有分割或碎裂的迹象，而L-CLD和EL-CLD处理的细胞核碎裂更严重，这可能与巨噬细胞脂质体吞噬能力增强有关。
为评价EL-CLD体外抗纤维化作用，通过观察外泌体、EL以及外泌体与空白脂质体(1:5)组合溶液对细胞活力的影响，发现经处理后的L细胞活力并没有显著变化，细胞毒性试验显示EL-CLD的细胞毒作用明显强于CLD和L-CLD，并且在0.5h和4h对EL-CLD的摄取是L-CLD的1.3倍(Fig.2E-2H)，表明EL-CLD对L-细胞凋亡和细胞毒作用的增强以及L-细胞对EL-CLD的蓄积增加可能与其与外泌体杂化后细胞积聚增加有关。此外，细胞核染色呈现出EL-CLD处理诱导细胞核碎裂，产生凋亡小体(Fig.2I)。这些体外实验结果表明，EL-CLD具有抑制巨噬细胞的增殖和成纤维细胞积聚的双重功能。
3.DiD脂质体在肺纤维化小鼠体内的组织分布
作者通过C57BL/6小鼠气管内单次大剂量注射博莱霉素(BLM)建立肺纤维化模型，采用Micro-CT对肺组织的形态特征进行鉴别(Fig.3A)。Masson染色和肺功能用于肝纤维化进展分期，发现第14天胶原沉积增加，肺泡壁增厚，肺泡损伤(Fig.3B)。采用全身气压容积描记仪(WBP)监测肺纤维化发生发展过程中的肺功能，BLM组小鼠的Ti/Te比值从第7-21天降至0.5以下，显示出不对称的呼吸周期(Fig.3C)。以上结果显示气管内注射BLM三周后，肺泡上皮损伤和胶原沉积严重，肺功能下降。因此，在气管内注射BLM三周后，对小鼠模型肺纤维化影响的研究。
为探讨EL-CLD在肺纤维化小鼠模型中的生物分布，将DiD染料负载脂质体，研究脂质体在主要脏器的蓄积、渗透和分布。在注射后24小时，EL组和EL-CLD组的DiD信号分别是空白脂质体的1.8倍和3.4倍，EL-CLD组在体内和体外的DiD信号在注射后48h仍然很强，并于24小时和48小时显示明显较弱的肝脾蓄积(Fig.3D-F)。这些结果表明，CLD脂质体可减少巨噬细胞聚集的滤过器官、肝脏和脾脏沉积。
第一次给药EL-CLD有效地抑制了肝脏的蓄积，并相应地增强了肺蓄积，第二次给药组比第一次在24h和48h时间点均显示出较强的DID荧光，但第二次EL-CLD显著减少1.5倍的肝脏蓄积。然而，在其他组中，第一次和第二次给药的肝脏蓄积没有差异(Fig.3E和3F)。此外，DAPI对肝、肺切片进行染色，发现EL-CLD组中产生最大的DiD荧光区(Fig.3G)。综上所述，由于CLD抑制巨噬细胞和EL-CLD对成纤维细胞归巢的双重作用，EL-CLD可以有效地减少肝脏摄取和增加纤维化肺中的蓄积。
4.EL-CLD在肺纤维化小鼠肝、肺组织中的分布
为进一步评价DID脂质体在肺纤维化小鼠肝、肺组织中的分布，对肝切片进行免疫荧光染色(Fig.4A)，发现空白脂质体和EL组的大多数红色荧光与绿色荧光标记F4/80阳性的巨噬细胞位于同一视野，表明沉积在肝脏中的脂质体被Kupffer细胞吞噬。EL-CLD组F4/80阳性细胞较少，且未与DID荧光共存，提示EL-CLD诱导Kupffer细胞枯竭，并且不沉积在肝脏内，分布于Kupffer细胞外，进一步揭示脂质体在纤维化肺组织中蓄积和渗透的细节。接着，用绿色荧光标记的α-SMA抗体对肺切片中出现的纤维化进行染色。与空白脂质体相比，EL-CLD组显示出最大的重叠黄色荧光，表明EL-CLD比其他治疗方法在纤维化部位积聚更多(Fig.4B)。最后，CD31荧光抗体标记肺血管以分析EL-CLD的穿透情况(Fig.4C和4D)。经EL-CLD治疗后，肺内DiD信号明显增强，且穿透到距离血管50μm以上的区域，表明肺内聚集明显增强，间质通透性增强。综上所述，EL-CLD在肺纤维化组织中蓄积以及间质穿透性显著增强，提示EL-CLD有可能用于更有效的肺纤维化给药。
5.NIN负载EL-CLD在肺纤维化治疗中的作用
考虑到EL-CLD具有良好的肺纤维化蓄积和渗透特性，作者将NIN（血小板衍生生长因子、FGF-2和内皮血管生长因子受体的三重酪氨酸激酶受体抑制剂）负载到EL-CLD(EL-CLD-NIN)中，以确定该系统是否能进一步提高其抗纤维化效果。CT扫描、肺指数、HE染色等显示，EL-CLD-NIN可使肺纤维化小鼠的肺高密度区显著减少，降低肺指数以及减少胶原沉积(Fig.5A-5H)。另外，作者对肺纤维化的主要生物标志物Hyp和MMP-7水平进行考察，发现EL-CLD-NIN治疗后其标志物水平降低(Fig.5I和5J)，表明EL-CLD-NIN具有减少ECM沉积和延缓纤维化进展的能力。肺纤维化小鼠生存率表明EL-CLD-NIN治疗组小鼠存活时间明显延长，60天存活率为87.5%，而L-NIN治疗组存活率仅为25%(Fig.5K)。总体而言，这些结果充分支持了EL-CLD可作为一种药物输送系统，并提高NIN治疗肺纤维化的效率。
6.EL-CLD-NIN抗肺纤维化作用的机制
为研究EL-CLD改善NIN抗纤维化效果的机制，TUNEL和F4/80双染色检测肝巨噬细胞凋亡，结果表明EL-CLD-NIN和L-CLD-NIN组的F4/80阳性巨噬细胞凋亡率均显著高于未用药组，可能与脂质体对巨噬细胞的耗竭作用有关；EL-NIN治疗后巨噬细胞凋亡的减少可能与成纤维细胞与外泌体结合有关(Fig.6A-C)。然而，负载CLD脂质体组约86%的凋亡细胞高于未负载CLD脂质体组，表明负载CLD的脂质体大部分被Kupffer细胞吞噬，从而降低了对正常肝组织的毒性。因此，EL-CLD-NIN具有优异的巨噬细胞耗竭作用以及安全性。另外，通过对EL-CLD-NIN治疗后肺巨噬细胞凋亡的评估，发现肺巨噬细胞比正常肺细胞或成纤维细胞有更大的耗竭倾向(Fig.6D-F)。
基于巨噬细胞产生的各种细胞因子招募炎症细胞和启动纤维化，作者通过免疫组化分析，发现EL-CLD-NIN治疗显著抑制IL-1β的分泌(Fig.6G)，说明EL-CLD-NIN的抗炎作用可能是由于EL-CLD递送系统导致巨噬细胞耗竭。EL-CLD-NIN和L-CLD-NIN显著降低TGF-β的表达，表明脂质体中的CLD具有减轻纤维化的能力(Fig.6H)。此外，细胞外基质沉积的关键生物标志物α-SMA在不同的NIN制剂治疗后在纤维化肺组织中的表达减少(图6I)，说明EL-CLD给药系统具有明显的肺巨噬细胞耗竭、抗炎作用，并可通过增加NIN的暴露而增强抗纤维化作用。
全文总结
作者设计EL-CLD给药系统，发现其能消耗Kupffer细胞，从而显著减少了Kupffer细胞在肝脏中的蓄积，并通过靶向递送显著增加了肺纤维化组织内的穿透。另外，将尼达尼布（NIN）载入EL-CLD以验证潜在增强的抗纤维化效果，发现肺巨噬细胞的耗竭抑制了纤维化细胞因子的释放，并促进了NIN的抗纤维化作用。因此，EL-CLD给药系统可能会发展成一种有效的成纤维细胞特异性治疗方法。
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