年7月，日本东京医学与牙科大学在JournalofHepatology杂志上发表一篇名为“Lossoffibrocystinpromotesinterleukin-8-dependentproliferationandCTGFproductionofbiliaryepithelium”的研究。本研究主要利用体外人诱导的多能干细胞模型以及CRISPR-Cas9技术，研究了先天性肝纤维化（CHF）的分子机制。先天性肝纤维化是由PKHD1基因突变引起的遗传性肝病。它编码的蛋白质纤维囊素功能障碍与CHF的发病机制密切相关。在体外人诱导的多能干细胞模型和患者样本中，本研究发现纤维囊素功能的丧失以白细胞介素8（IL-8）依赖的方式促进胆管细胞的增殖和结缔组织生长因子（CTGF）的产生。这些结果表明，IL-8和CTGF对CHF的发病机制至关重要,可以成为阻断CHF进展的新的治疗靶点。
1.生成PKHD1-KOiPSC衍生肝祖细胞作为先天性肝纤维化模型本研究中的iPS细胞模型来自健康个体的人类，研究人员利用CRISPR/Cas9基因组编辑方法对iPSC的PKHD1基因进行敲除，获得PKHD1-KOiPS克隆作为实验组。另外，杂合突变的PKHD1(PKHD1-hetero)iPS克隆作为对照细胞系，以排除通过基因组编辑方法产生的脱靶突变影响该克隆表型的可能性。然后，将PKHD1-KO或PKHD1-HeteroiPS克隆分化成肝系（iPSC-HPC）。这些类肝祖细胞同时表达肝和胆的标志物，并且能稳定的培养。2.PKHD1的缺失增加了iPSC源性胆管囊肿的细胞增殖
iPSC衍生的HPC细胞形成了囊状结构，表现出胆管细胞特征和细胞极性，称为胆管囊肿CCs。iPS衍生的胆管细胞样细胞具有胆管细胞的结构和功能特征。其中，增殖细胞核抗原（PCNA）的产生和细胞周期蛋白家族基因的表达在PKHD1-KOCCS中均显著高于PKHD1-HeteroCCS。数据表明，PKHD1-KOiPS衍生的胆管细胞的增殖与之前研究的CHF动物模型中结果相似，表明这种异常增殖类似于CHF患者肝脏中观察到的导管板畸形。3.IL-8产物以自分泌的方式促进了PKHD1-KOCCs的异常增殖为了研究胆管细胞的异常增殖，研究员对CHF模型PKHD1-KOCCs进行了基因表达分析。IL-8在PKHD1-KOCCs较PKHD1-HetersCCs中显著过表达。为了确认IL-8的增加是否引起胆管细胞异常增殖，对CCs进行IL-8的拮抗剂进行处理，发现CCs的数目和大小是减少的。反之，使用IL-8刺激物处理CCs，CCs的数目和大小是增加的。所以，自分泌的IL-8和IL-8-CXCR1/2信号级联是缺乏纤维囊素的人胆管细胞异常增殖的必要因素。4.在胆管细胞中纤维囊素的缺乏通过MAPK通路增加了IL-8的表达
为了阐明纤维囊素的缺乏是通过MAPK通路增加了IL-8的表达的分子机制，研究人员对PKHD1-KO和PKHD1-HeteroCCs的MAPK通路磷酸化进行了评估。PKHD1-KOCCs中发现ERK（MAPK3），JNK（MAPK8）和c-jun磷酸化是上调的。接着，探究了MAPK通路的激活与IL-8的表达关系。MEK-1和MEK-2的抑制剂U的处理CCs后，发现IL-8的表达是显著的抑制的。同样，加入JNK抑制剂，IL-8表达也是显著抑制。所以MAPK异常的激活（尤其是MEK和JNK），可以增加IL-8的表达，从而导致纤维囊素缺乏的胆管细胞异常增殖。
5.IL-8增加PKHD1-KO胆管囊肿的CTGF生成为了研究异常增加的IL-8产生与纤维化变化之间的关系，研究人员分析了与IL-8共用转录因子的候选基因的表达。其中，PKHD1-KOCCs较PKHD1-HeteroCCs明显升高了CTGF（结缔组织生长因子）的表达。IL-8的刺激物处理PKHD1-KOCCsCTGF也表达增加。MEK抑制剂能显著抑制PKHD1-KOCCs中CTGF和TGF-b1的表达。相反，CTGF刺激上调了PKHD1-KO细胞中IL-8的表达。这些数据表明，在缺乏纤维囊素的胆管细胞中，IL-8和CTGF表达是相互促进的。IL-8和CTGF之间的正反馈机制受MAPK激活的调节，包括MEK和JNK-c-Jun通路。6.CHF患者肝脏中IL-8、CTGF表达增加为了验证在体外模型PKHD1-KOiPS-CCs中结果的可靠性，研究人员使用CHF患者的肝脏和血清样本来进行验证IL-8和CTGF的表达水平。发现肝脏中IL-8和CTGF表达增加与体外iPSC-CHF模型的研究结果一致。结论：本研究利用体外人诱导的多能干细胞模型研究发现IL-8和CTGF对CHF的发病机制至关重要。另外，IL-8受体抑制剂可抑制PKHD1-KO胆管细胞的异常增殖和CTGF的表达，MEK抑制剂也可抑制IL-8和CTGF的表达。表明IL-8，CTGF和MAPK将成为阻断CHF进展的新的治疗靶点，未来使用靶向这些分子的药物进行临床试验，可能提高患者的生存，减少患者对肝移植的需求。
稿件来源：营销中心Tina
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