原发性硬化性胆管炎（PSC）是一种特发性，慢性，胆汁淤积性肝病(cholestaticliverdisease，CLD)，其特征在于慢性胆道发炎，导管周围纤维化和胆道破坏。PSC经常发展为肝硬化，并具有发展胆管癌和胆囊癌的重大风险。遗传，免疫和环境因素均会导致疾病进展。然而，对PSC的病因和病原体了解仍然很少。年3月14日来自德国比亚琛工业大学的ChristianTrautwein教授团队在Gut（IF:14）发表了题为IntestinaldysbiosisaugmentsliverdiseaseprogressionviaNLRP3inamurinemodelofprimarysclerosingcholangitis的文章。
研究使用了MDR2基因敲除小鼠(Mdr2?/?)，Mdr2的基因缺失导致胆汁中磷脂酰胆碱完全不存在，从而导致硬化性胆管炎和胆石症，并伴有进行性肝损伤。Mdr2?/?模型与人的PSC过程非常相似，代表PSC动物模型。研究人员研究了肠肝轴在MDR2基因敲除小鼠(Mdr2?/?)模型中的功能作用，实验观察Mdr2缺失对小鼠肝脏和肠道胆汁酸及微生物菌群的影响，并且通过移植粪菌，研究了Mdr2?/?在肠道菌群失调中的功能作用。
Mdr2缺乏导致胆汁淤积性肝损伤
Mdr2-/-小鼠在8周和52周时的血清转氨酶（ALT）水平显着升高（图1A，左图），显示出严重的肝损伤。Mdr2-/-小鼠的肝重量比WT小鼠高。此外，与WT小鼠相比，Mdr2-/-小鼠的胆道系统显示出与血清磷酸碱性酶（AP，图1A，右图）和胆汁酸（图1B）的血清浓度显着增加相关的阻塞。在Mdr2-/-小鼠中，血清胆固醇水平明显降低。Mdr2-/-小鼠的肝脏组织学表现出强烈的慢性导管周围炎性反应，逐渐发展的胆管增生和门静脉周围纤维化（52周）（图1C）。因此，所有Mdr2-/-雄性小鼠在1年后均出现肉眼可见的肝肿瘤。Mdr2-/-小鼠的肝表现出强烈的导管反应，伴有门静脉炎症和细胞凋亡。这种升高的细胞凋亡率和炎症反应之后是有丝分裂活性增加。与WT对照相比，针对Ki-67的免疫组织化学（IHC）染色证实了52周龄Mdr2-/-小鼠的细胞周期活性增加。
免疫细胞浸润是急性和慢性肝损伤的主要致病特征。荧光激活细胞分选（FACS）分析和针对CD45的IHC染色显示，与WT对照相比，Mdr2-/-肝脏中白细胞浸润显着增加（参见在线补充图2B）。由FACS证实，Mdr2-/-肝显示MCP-1表达显着增加，这与炎性单核细胞衍生巨噬细胞（MoMFs）。F4/80IHC染色证实了炎性细胞浸润，显示Mdr2-/-肝脏中有明显的免疫细胞浸润，尤其是在周围区域，这与CD68和F4/80肝脏mRNA表达较高相关。总的来说，这些数据显示，以MoMF募集为特征的Mdr2-/-肝脏炎症增加，从而刺激了PSC样表型的发展。
Caspase-8依赖性细胞凋亡信号转导对Mdr2-/-小鼠的疾病进展至关重要
Mdr2-/-肝显示出较高的裂解的caspase-3和caspase-8表达（图1D和E）。此外，在Mdr2-/-肝脏中，具有激活的caspase-3的细胞数量显着增加，这些细胞大部分位于胆管周围（图1F和G）。与野生型肝脏相比，Mdr2-/-中RIP3蛋白的表达被取消，而MIP2-/-中的RIP1则略有上调（图1H）。另外，参与细胞凋亡的其他标志物，例如Bcl2和Bax的mRNA表达在Mdr2-/-肝脏中显着增加。因此，这些结果表明Mdr2-/-小鼠的肝损伤可能是由细胞凋亡介导的，而不是通过坏死性坏死介导的。研究人员发现caspase-8在Mdr2-/-肝脏中被强烈激活后（图1D和E），研究人员发现接下来的目的是了解其在疾病进展中的作用。与雄性Mdr2-/-动物相比，雄性Mdr2-/-/Casp8Δhepa小鼠在12周和26周龄时未显示转氨酶水平的显着差异（图1I）。这些结果表明，尽管肝细胞中的caspase-8具有很强的激活能力，但它对于Mdr2-/-肝脏的疾病进展却是不可或缺的。
图1
人PSC和Mdr2-/-肝脏中NLRP3炎性小体的明显活化
炎性小体是激活caspase-1的细胞内信号平台，然后将pro-IL-1β裂解为活性IL-1β。26NLRP3炎性小体与多种肝病有关。为了研究NLRP3激活与PSC的相关性，对PSC患者和健康对照组患者的人肝切片进行了NLRP3染色（图2A）。PSC患者的IHC显示NLRP3和IL1-β阳性细胞显着增加。IL1-β阳性细胞表明炎症小体激活，而在健康对照中则没有（图2A和B）。研究人员检查了患者样本中肝纤维化程度与NLRP3-，IL-1β和临床MELD评分的相关性。在更晚期的病例中，NLRP3和IL1β的活化程度增加（对于NLRP3，r=0.，p=0.；对于IL-1β，r=0.，p=0.）。此外，根据临床参数计算出的MELD评分与纤维化程度相关（r=0.，p=0.）。基于这些发现，研究人员研究了NLRP3在Mdr2-/-小鼠炎症小体激活的背景下的作用。在8周龄和52周龄Mdr2-/-肝脏中，IHC显示NLRP3阳性细胞显着增加（图2C和D）。此外，在Mdr2-/-肝脏中发现了NLRP3，pro-IL-1β和IL-1β的蛋白过表达（图2E和），这与NLRP3，IL-1β的较高mRNA水平相符。，这些肝样本中的ASC，caspase-1和caspase-11（图2G）。这些结果表明，Mdr2-/-小鼠胆汁淤积性肝损伤是由明显的炎症小体激活介导的。
图2
Mdr2-/-小鼠肠道菌群组成的改变
在Mdr2-/-小鼠中，研究人员发现血清胆汁酸成分发生了重大变化。由于胆汁酸代谢的变化可能影响肠肝循环，从而改变微生物群组成，因此研究人员研究了Mdr2-/-小鼠是否表现出肠道营养不良。虽然加权UniFrac距离的PCoA轴1和2未显示清晰的聚类，但基于Bray-Curtis相似性的非度量多维标度（NMDS）分析显示52周龄的Mdr2-/和野生型同窝伴侣之间存在清晰的分隔小鼠（图3A）。单独的垃圾和笼子都对微生物群落结构产生了重大影响。凯奇（Cage）根据排列的多元变异数分析（ADONIS）解释了很大的比例，占总菌群变异能力的34％（R20.34，***p0.）。单个垫料也对微生物群特征有显着影响，并解释为高达0.25％（R20.25，**p0.）。重要的是，尽管观察到了笼效应，但这些独立的共居实验显示了Mdr2-/-基因型对微生物群组成的可再现影响，这也解释了高达10％的肠道微生物群变异性（R20.，**p0.）（图3B）。
与野生型小鼠相比，Mdr2-/-中微生物种类的多样性降低了（图3C）。通过在所有属上执行计算的LDA效应大小分析28，狼尾草科的细菌脱颖而出，因为它们在WT和Mdr2-/-同窝幼仔之间受到最显着的调控（图3D）。WT小鼠中属于鞭毛藻科的几个细菌操作生物分类单位（OTU）有所增加，而Mdr2-/-小鼠中鞭毛藻科uncultured_OTU_69和螺旋藻-OTU_2则有所不同（图3D）。但是，席尔瓦数据库v不支持对该OTU进行更深入的分类。有趣的是，鼠尾草科植物已隐含在人PSC中，并被表征为可产生异胆汁酸，这表明所观察到的胆汁酸成分变化可能会影响微生物的胆汁酸代谢。重要的是，研究人员观察到了鼠尾草科植物之间存在显着相关性。总而言之，这些数据表明Mdr2-/-小鼠中的CLD导致肠道菌群组成明显改变并导致特定的微生物群签名。
图3
Mdr2的敲除导致肠道屏障破坏
肠道营养不良可能会引起肠道屏障功能的改变。因此，研究人员研究了肠道上皮。H＆E染色的组织切片的组织学分析未显示Mdr2-/-和WT小鼠之间的显着差异。上皮紧密连接维持小肠闭合带1（ZO-1）的肠屏障。一种支架蛋白，在紧密连接形成中起关键作用。在不同时间点，Mdr2-/-小鼠结肠和回肠中的ZO-1蛋白和mRNA表达显着降低。免疫染色进一步证实了Mdr2-/-小鼠的顶端和基底外侧细胞区域的肠绒毛上皮中的ZO-1下调（图4C）。此外，在Mdr2-/-小鼠的结肠中，黏液层的完整性受到干扰。与WT小鼠相比，Mdr2-/-的粘液明显更薄（图4D）。WT小鼠在给药4小时后血清FITC-右旋糖酐水平非常低，而分光光度法显示Mdr2-/-小鼠血清中FITC-右旋糖酐的浓度明显较高（图4E）。通过测量门静脉血中的脂多糖（LPS）浓度进一步证实了通透性的提高（图4F）。与野生型对照组相比，Mdr2-/-小鼠的门静脉血中LPS水平显着升高，而两组中中心静脉血中的LPS水平没有差异。
最后，为了评估Mdr2-/-和WT小鼠肝脏中的细菌易位，通过qPCR使用DNA通过qPCR确定了相对于基因组DNA和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）总量标准化的细菌16S核糖体RNA基因的相对丰度。与WT伴侣伴侣对照相比，Mdr2-/-小鼠的肝脏显示总细菌和肠杆菌科细菌的rRNA基因的相对丰度显着增加（图4G）。此外，在52周的时间点，在所有Mdr2-/-肝脏中均可检测到肠球菌rRNA基因，而在所有WT对照小鼠中均未检测到（图4G）。总而言之，这些数据显示Mdr2-/-小鼠的屏障功能受损，促使肠道通透性增加和微生物相关分子模式（MAMPs）易位。
图4
Mdr2缺失激活肠道中的炎性体信号传导
健康的肠道具有强大而平衡的免疫系统。一方面，它防止了针对共生微生物和抗原的炎性反应所引起的有害的附带损害，另一方面，它确保了针对入侵病原体的保护。在Mdr2-/-小鼠的肠道中发现CD45免疫细胞的浸润增加。此外，Mdr2-/-小鼠的结肠和回肠中还有更多的CD11b和F4/80阳性细胞。这与Mdr2-/-小鼠中较高的F4/80mRNA水平相关，从而触发了例如肿瘤坏死因子-α的促炎细胞因子表达的增加。研究人员已经观察到Mdr2-/-肝脏中炎症小体激活的增加，研究人员想知道NLRP3激活是否也可能参与了这些动物的肠道表型的介导。免疫组织化学证实，与WT小鼠相比，八周龄和52周龄的Mdr2-/-小鼠在石蜡包埋的结肠和回肠切片中表现出明显更高的NLRP3阳性细胞（图5A）。这些发现与Mdr2-/-小鼠结肠和回肠中更高的NLRP3mRNA表达相伴（图5B）。此外，在Mdr2-/-小鼠结肠中发现NLRP3，pro-IL-1β和IL-1β蛋白表达增加（图5C），RT-qPCR分析表明ASC和caspase-1上调（图5D）。这些数据表明，Mdr2-/-小鼠的肠道NLRP3炎性体活化与肝脏疾病的进展有关。
图5
Mdr2-/-微生物群的转移在健康的WT小鼠中引起肠道营养不良
由于Mdr2-/-小鼠肠道菌群组成的变化与NLRP3炎性小体激活增加和肠屏障完整性的丧失相关，研究人员接下来寻求研究Mdr2-/-菌群对肠道稳态的影响。为此，将来自Mdr2-/-或WT对照小鼠的微生物群经口管饲转移到健康的WT小鼠中1周。Mdr2-/-的粪便微生物群转移（FMT），而不是野生型WT的微生物群导致血清转氨酶活性显着增加，从而导致受体野生型小鼠肝损伤增加。该表型由受体WTFMT（Mdr2-/-）小鼠结肠和肝脏中明显的NLRP3炎性小体激活介导（图6C）。FTC对Mdr2-/-的微生物群的抑制抑制了WTFMT（Mdr2-/-）小鼠中ZO-1紧密连接的表达，如FITC-葡聚糖测定法中的蛋白质印迹分析，免疫荧光染色和肠通透性增加所证实（图6D-F）。与WTFMT（WT）同窝仔相比，针对CD45的IHC染色显示WTFMT（Mdr2-/-）小鼠中白细胞浸润增加。炎性浸润以MoMFs为主，表明这些细胞是观察到的表型和肠道衍生的炎性信号的早期传感器的媒介物。WT和Mdr2-/-供体小鼠。有趣的是，源自Mdr2-/-的微生物群的转移在受体WT小鼠的细菌群落结构中引起了显着变化（图6H）。当比较FMT之前（第0天）和之后（第7天）WTFMT（Mdr2-/-）的微生物群组成时，基于负二项分布（DESeq）分析的差异基因表达分析表明，共有12个细菌组明显上调并8个在微生物群转移中被下调（图6H）。有趣的是，Lachnospiraceae家族中有3个差异调控的OTUs，研究人员在WTFMT（Mdr2-/-）小鼠中观察到了拟杆菌属S24-7组的扩增，这可能具有致生细菌的潜力。相反，在转移WT微生物群时，在属于乳杆菌科的三个组中仅观察到微小变化（图6I）。FMT后，WTFMT（Mdr2-/-）的微生物群组成与Mdr2-/-供体微生物群相似，而WTFMT（Mdr2-/-）的微生物群在几个OTU中与WTFMT（WT）同窝微生物群不同总的来说，这些数据表明，在Mdr2-/-小鼠中观察到的肠道营养不良可通过FMT传播，并导致炎症性肝病。
图6
泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂IDN-治疗可改善Mdr2-/-小鼠的肝损伤
在Mdr2-/-肝脏中，研究人员发现了不同的胱天蛋白酶激活。虽然肝细胞中的caspase-8缺失不能挽救该表型，但研究人员发现caspase-1和NLRP3炎性小体强烈激活。因此，研究人员试图通过用IDN-治疗动物来测试系统性泛半胱天冬酶抑制作用，尤其是caspase-1和caspase-8。用IDN-治疗的8周龄Mdr2-/-小鼠表现出肝损伤的明显减轻（图7A）。另外，与溶媒治疗的小鼠相比，H＆E染色显示IDN-治疗的Mdr2-/-肝脏的门静脉炎症减少和胆管增殖降低（图7B），这些变化与血清胆汁酸浓度显着降低有关IDN-治疗后的Mdr2-/-小鼠体内（图7C）。为了测试IDN-对caspase抑制的功能作用，研究人员研究了caspase-8活性。IHC染色和免疫印迹分析显示，IDN-治疗后Mdr2-/-肝脏中caspase-8表达大大降低（图7D和E）。此外，IDN-治疗后，Mdr2-/-肝中裂解的caspase-3蛋白表达（图7E）和caspase-3酶活性（图7F）显着降低。
图7
IDN-治疗可重塑微生物群，并抑制Mdr2-/-肝脏中的炎性体活化
令人惊讶的是，IDN-治疗不仅显着改善了肝脏疾病并降低了血清胆汁酸浓度，而且部分逆转了Mdr2-/-微生物群的特征（图8A）。值得注意的是，Mdr2-/-窝伴侣小鼠±IDN-（R20.3，p0.**，ADONIS）中肠道菌群总变异性的20％可以用``IDN治疗"因子解释。接下来，研究人员在LEfSe分析中分析了泛半胱天冬酶抑制剂治疗对分离了52周龄Mdr2-/-和WT小鼠的细菌的影响（图3D）。与WT微生物群相比，最初在Mdr2-/-中过度扩张的OTU2在IDN-处理后现已显着减少（图8A）。通过ZO-1Westernblot证实，通过IDN-抑制caspase可以改善Mdr2-/-小鼠的肠屏障完整性（图8C和D）。肠道营养不良可以驱动肝炎性体的活化，研究人员的结果证明了炎性体的强表达随着Mdr2-/-小鼠肠道肝轴内疾病的进展，研究人员研究了IDN-治疗对炎症小体活化的影响。Westernblot分析显示IDN-处理后Mdr2-/-小鼠结肠和肝脏中NLRP3，pro-IL-1β，IL-1β和caspase-1的蛋白质表达降低（图8E）。施用IDN-导致Mdr2-/-肝脏中NLRP3，ASC，IL-1β和caspase-1的mRNA表达显着降低（图8G）。与这些发现相伴的是，与媒介物治疗的Mdr2-/-小鼠相比，IDN-治疗后的Mdr2-/-肝脏中肝F4/80和IL-6的mRNA表达显着降低（图8G）。由于MoMF被确定为Mdr2-/-小鼠中观察到的炎症反应的重要介质，因此研究人员针对CD11b进行了免疫荧光染色，以分析IDN-治疗对免疫细胞浸润的影响。与H＆E组织学一致，研究人员观察到IDN-处理的Mdr2-/-小鼠中CD11b+细胞的数量与媒介物处理的Mdr2-/-小鼠相比明显减少。caspase激活显着促进了Mdr2-/-小鼠的疾病进展，并表明NLRP3炎性小体激活在此过程中起着重要作用。
图8
综上所述，研究人员的结果表明肠道菌群失调是Mdr2?/?小鼠慢性阻塞性肺疾病的重要驱动因素。研究人员的数据指出了胆汁淤积引起的肠道生物失调在肝病进展中的直接致病作用。在这里，NLRP3炎症体是肠肝轴的核心介质。肠道微生物区系和NLRP3炎症小体代表了CLD的有趣治疗靶点，这可能也与人类相关。
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