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通过治疗信使RNA(mRNA)的瞬时蛋白表达极大地限制了病毒基因治疗中遇到的风险，如插入突变、严重的免疫应答和潜在的致癌基因激活。mRNA技术在疫苗开发和免疫肿瘤学方面已经取得了巨大的进展。与病毒载体相比，LNPformulatedmRNAs可屏蔽体液和细胞免疫，并能以较低成本大量生产。mRNA治疗剂特别适合于治疗不需要持续和终身表达治疗蛋白的损伤，并且提供了优于病毒基因治疗的优点，即可适应各种医学状况，例如肝纤维化和肝硬化，每年，这类疾病导致数百万人死亡，是全球范围内的主要医疗负担。这类新的基于mRNA的疾病在肝纤维化和肝硬化中的潜力仍有待开发。
简介
年8月25日，来自德国汉诺威医学院的AmarDeepSharma及其团队在JHepatol(IF:20.)杂志上发表名为TherapeuticHNF4AmRNAattenuatesliverfibrosisinapreclinicalmodel的研究[1]。
主要结果
人类HNF4AmRNA的修复可改善纤维化肝细胞的功能
首先，我们通过Ishak评分证实肝纤维化患者内源性HNF4AmRNA水平降低(图1A)。在来自德国汉诺威医学医院的两个队列中，肝组织表现出HNF4AmRNA的纤维化阶段依赖性减少。类似地，来自纤维化人肝脏的原代人肝细胞(PHH)中HNF4A蛋白表达降低(图1B)。
然后，我们检查了体外合成的HNF4AmRNA是否产生功能活性HNF4A蛋白。我们将野生型(非密码子优化)或密码子优化的HNF4AmRNA转染到人类宫颈癌细胞系(HeLa)细胞中，因为这些细胞缺乏内源性HNF4A表达。经密码子优化的HNF4AmRNA转染细胞显示出比野生型HNF4AmRNA更高的HNF4A蛋白水平(图1C)。ZsGreen转染的HeLa细胞作为我们的对照。随后在PHH进行的转染，证实了HNF4Atarget基因APOA2、APOB和F7的显著上调，证实了具有功能活性的密码子优化mRNA(图1D)。因此，我们使用密码子优化的HNF4AmRNA进行进一步实验。
图1.HNF4AmRNA递送恢复了纤维化PHH的功能
LNP包裹的mRNA靶向递送至纤维化肝细胞
我们建立了高效的LNP介导的mRNA递送到小鼠纤维化的肝细胞中。LNP通过与载脂蛋白E相互作用直接进入，随后通过肝细胞内吞作用被内化。然而，LNP配方的mRNA是否有效地到达纤维化的肝细胞，仍是未知的。将携带Photinuspyralis荧光素酶(Luc/LNP)或ZsGreen(ZsGreen/LNP)的mRNA的LNP经静脉注射到四氯化碳诱导的纤维化和非纤维化对照(WT)小鼠中(图2A)。活体成像显示，在两组中Luc/LNP注射后8小时至小时期间，仅在肝脏中具有稳健的生物发光活性(图2B)。共定位研究显示，在纤维化小鼠和对照小鼠的肝细胞中特异性表达稳健的ZsGreen蛋白，但在其他肝细胞中不表达(图2C)。我们的研究结果表明，LNP配方的mRNA技术可以特异性、高效地靶向小鼠纤维化的肝细胞。
图2.LNP成功地将mRNA递送到纤维化BALB/c小鼠的肝细胞
HNF4A-Pon1介导的巨噬细胞浸润减少和M1-M2极化调节有助于减少纤维生成
为了进一步验证PON1是否参与了HNF4A介导的纤维生成抑制，我们将PMH病毒与HNF4AmRNA和siRNA病毒共转染以抑制Pon1(图7A)。Pon1SiRNA转染的PMH显示出强大的Pon1敲除(图7B)。转染48小时后，我们收集细胞培养基并检测其对KC和HSC的作用(图7A)。据报道，Pon1可降解C-C基序趋化因子配体2(CCL2)，一种促炎趋化因子和肝纤维化的关键调节剂。我们证实，在从HNF4AmRNA转染的PMH收集的培养基中，CCL2分泌受到强烈抑制(图7C)。仅转染HNF4AmRNA的细胞培养液增加了M2巨噬细胞的数量，认为M2巨噬细胞是抗炎巨噬细胞(图7D，E)。值得注意的是，已证明向M2巨噬细胞的转化可抑制小鼠的纤维化。从PMH采集的培养基与Pon1siRNA和HNF4AmRNA共转染，诱导了M1表型(图7D，E)。IL6、iNOS、Arg1和Fizz1的基因表达分析证实，HNF4A驱动巨噬细胞进入M2表型，而Pon1的抑制抑制了向M2巨噬细胞的转化(图7F)。
图7.HNF4A-Pon1通路诱导巨噬细胞极化和HSC失活
HNF4AmRNA递送的单细胞RNA测序分析
为了进一步了解HNF4A诱导的分子和细胞变化，我们首先向小鼠单次注射四氯化碳(8μl/g，10%四氯化碳)，从而诱导急性肝损伤。24小时后，我们给小鼠注射一次HNF4A/LNP或ZsGreen/LNP(图8A)。我们选择了急性损伤模型，而不是慢性发展的肝纤维化模型，因为这能够确定HNF4A的直接靶点。注射HNF4/LNP后24小时，我们通过Percoll密度梯度离心法分离了所有肝细胞，并对其进行了10xGenomics单细胞RNA测序(scRNA-seq)。我们对个肝细胞进行的scRNA-seq分析确定了不同的肝细胞群体，包括肝细胞、胆管细胞、HSC、巨噬细胞、KC、中性粒细胞、LSEC、树突细胞、血浆B细胞和T细胞(图8B、C)。肝细胞和巨噬细胞表现出显著的转录组学差异(图8D，E)。注射HNF4A/LNP的小鼠显示泛巨噬细胞标记CD68的表达降低(图8F)。据报道，MacSpectrum计算分析scRNA-seq数据，以确定巨噬细胞极化。我们的MacSpectrum分析提示向M2-巨噬细胞过渡(图8G-J)。
图8.单细胞RNA测序证实，HNF4A/LNP处理可减少巨噬细胞浸润和HSC活化
结论及展望
在全球范围内，肝纤维化和肝硬化仍然是未得到满足的医疗需求，并导致高死亡率。在此，我们利用一种有前途的新兴mRNA治疗方法来治疗肝纤维化和肝硬化。本研究证明，通过脂质纳米粒包裹的mRNA修复关键基因HNF4A可减少多种纤维化和肝硬化小鼠模型的损伤。我们的研究提供了一个概念证明，即mRNA治疗将是逆转肝纤维化和肝硬化的一种有前景的策略。总之，我们的发现首次提供了HNF4AmRNA治疗适用于肝纤维化治疗的直接的临床前证据。
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